泛瘤种丨精准医疗，免疫治疗生物标志物，超进展以及假性进展
从目前的临床实践应用来看，肺癌靶向治疗[EGFR（18、19、20、21、遗珠、胞外域、复合突变）、ALK、ROS1、RET、MET、HER2、KRAS、BRAF、NTRK、NRG1等]、抗血管生成治疗，免疫治疗（免疫治疗生物标志物、超进展、假性进展，耐药机制），化疗，鳞癌诊疗，小细胞癌诊疗，非小细胞肺癌脑转移，非小细胞肺癌术后辅助治疗（点击阅读）等这几大主题值得探讨，今天我们分享免疫治疗生物标志物，超进展以及假性进展。
免疫治疗生物标志物近年来，免疫治疗取得了令人瞩目的成果，诸多临床研究已证实免疫治疗可改善肿瘤患者的预后，显著延长患者的生存期。与此同时，免疫治疗生物标志物的探索也成为了免疫治疗研究的热点。 生物标志物可以协助判断预测治疗的有效性，也承担着指导临床药物使用的“重要角色”。目前用于预测免疫检查点抑制剂疗效的标志物主要有以下几种：PD-L1正常组织极少表达PD-L1，而多种肿瘤细胞如肺癌、恶性脑瘤、黑色素瘤、胃癌及胰腺癌细胞高表达PD-L1，此外肿瘤微环境中的髓系细胞也可表达PD-L1。有研究报道在不同肿瘤类型中，肿瘤组织PD-L1的表达与患者的临床应答间存在紧密联系。因此关于肿瘤组织PD-L1 的表达对于临床疗效的预测性及其作为生物标记物筛选患者的可行性受到了广泛关注。CA209-003试验：此实验最先明确了肿瘤细胞PD-L1表达与患者治疗反应间的关系。在45例黑色素瘤、NSCLC和RCC患者中，25例为PD-L1阳性，21例为PD-L1阴性，治疗缓解情况出现在9例（36%）阳性患者中，而阴性患者中没有出现。在这一试验中，试验者运用鼠源抗人PD-L1单抗5H1对肿瘤细胞进行免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）染色，并且界定IHC染色≥5% 的患者为PDL1表达阳性。
起初认为肿瘤组织PD-L1表达可作为筛选患者的预测因子，但随着研究的深入有许多问题出现。
问题1：抗体的选择。PD-L1表达的检测多通过IHC方法，那么一个能够检测经福尔马林固定和石蜡包埋的组织样本中分子的合适单抗是十分重要的。当前各临床试验应用的单抗主要有以下四种：28-8、22C3、SP163及SP142。其中22C3抗体已获FDA 批准，被作为用于筛选接受Pembrolizumab治疗的NSCLC患者的伴随诊断方式。目前供应的抗体都需要繁琐且不可靠的抗原修复程序，而且不同试验者运用的抗体往往各不相同，很难界定它们的优劣。
问题2：确定PD-L1表达阳性的最佳界限值。一个良好的界限值既有助于确认更多对治疗有反应的患者，同时在阳性和阴性患者间应存在显著差异。起初，常选择IHC染色≥5% 作为阳性。根据一些研究的反馈，这一界限值似乎是合理的。例如，在CA209-016试验中，在接受Nivolumab和Ipilimumab 联合治疗的RCC 患者中，在以1%作为界限值时，PD-L1 阳性组和阴性组的客观缓解率（Objective responserate，ORR）没有差异（50% vs 55%）；当界限值变为5% 时，两者间出现显著差异（56% vs 25%）。同样在接受Nivolumab治疗的转移性黑色素瘤患者中，以5%作为界限值，确认了更多缓解患者（ORR为44% vs 13%），而当界限值为1%时，阳性组和阴性组的差异变小（ORR为35% vs 13%）。然而在另一些研究中，以1%作为界限值同样在PD-L1表达阳性和阴性的患者间显示了显著差异。在KEYNOTE-010试验中，接受Pembrolizumab 治疗的晚期黑色素瘤患者中，以1%作为界限值具有显著差异。该研究也用10%作为界限值进行分析，发现其对于缓解患者的确认没有优势。另外，在接受Pembrolizumab治疗的NSCLC患者中，以1%作为界限值，ORR在PD-L1阳性组、阴性组分别为25%、13%；随后以50%作为界限值区分亚群，结果显示这部分患者的ORR进一步改善（45.2%）。这些结果指示单一界限值对于数据分析而言过于狭隘，因而临床试验不能依靠单一界限值，而是需要根据不同肿瘤类型与治疗方式选择不同的界限值进行分析。
问题3：PD-L1的生物学特性。比如肿瘤具有异质性，同一个病灶的不同位置，不同病灶之间的PD-L1表达是不同的，那么究竟该信赖哪一个？另外，PD-L1的表达是诱导性的、动态表达，也就是说在治疗的不同阶段，不同的治疗方式是会影响PD-L1的表达的。不同平台间检测PD-L1表达水平的一致性不佳，检测方法也尚存较大争议。因此，PD-L1的表达给不了一个绝对的可以用免疫药物且效果好，或者不能用免疫药物的判断。这也决定了PD-L1不是一种完美的预测免疫治疗的生物标志物，但是可以参考。
TMBTMB是指肿瘤基因组中去除胚系突变后的体细胞突变数量。肿瘤TMB越高，则肿瘤产生的新抗原越多，T细胞反应和抗肿瘤反应越强。其中，在黑色素瘤、肺癌、膀胱癌和胃肠道肿瘤中，TMB表达最高。
两项研究，Nat Rev Cancer发表的回顾性数据：PD-1/PD-L1抑制剂在各瘤种的疗效均与TMB成正相关。N Engl J Med发表的研究：在接受PD-1或PD-L1抑制剂治疗的27个瘤种肿瘤患者中，各瘤种ORR均与TMB水平呈正相关，TMB表达水平越高，PD-1/PD-L1抑制剂的治疗效果越好。
另外，来自临床研究的生物标志物分析显示，高TMB与I-O治疗应答强烈相关，高TMB是I-O治疗应答的生物标志物。
CheckMate026研究：高TMB组，纳武利尤单抗（Nivolumab）的ORR较化疗明显提高（47%对比28%）且PFS明显延长（9.7个月对比5.8个月）。
CheckMate568研究：高TMB患者的ORR升高。
CheckMate227研究：探索了TMB作为疗效预测标志物的PFS结果，也探索了PD-L1分层的OS结果。结果显示，纳武利尤单抗联合伊匹单抗治疗高TMB患者的PFS显著优于化疗，1年PFS率分别为43%和13%，中位PFS分别为7.2和5.4个月（HR=0.58，P=0.0002）。在高TMB人群中，无论PD-L1表达与否，免疫联合免疫治疗PFS均优于化疗。
继PD-L1之后，TMB逐步成为预测免疫检查点治疗疗效的潜在标志物。作为一种更广谱的免疫治疗，已从临床研究热点正走向临床应用。但TMB作为预测标志物还有很多问题，如TMB的检测由于依赖基因测序，目前成本还是要高于PD-L1检测；不同平台的检测标准不统一；标本存放时间对TMB的结果判断也会有一定影响等。随着NGS panel的获批，TMB检测也将慢慢走近临床实践。在具体的临床实践中，如果组织的样本量不够，是否可以使用ctDNA来检测TMB也是未来临床检测TMB状态需要考虑的问题。
TMB&PD-L1是I-O治疗应答的独立标志物，CheckMate012，026和227（NSCLC）研究的分析结果显示，TMB和PD-L1表达无相关性。Atezolizumab（NSCLC和UC）研究的数据同样证实，TMB和PD-L1表达无相关性或相关性弱。
肿瘤浸润淋巴细胞（Tumorinfiltrating lymphocytes）本身也可以作为一种免疫疗法。手术切除的肿瘤组织，大部分是肿瘤细胞，也有少部分淋巴细胞。科学家可以通过一些培养方法把这些肿瘤组织中的淋巴细胞扩增起来。简单说就是从手术切除的肿瘤组织中分离扩增TIL细胞，扩增出来的细胞主要是CD4+和CD8+ T细胞，然后体外培养一段时间得到足够多的TIL细胞，回输到患者体内发挥抗癌作用。因为PD-1/PD-L1抑制剂发挥作用，也需要肿瘤附近淋巴细胞的参与，所以TIL的丰度也可以作为预测PD-1/PD-L1抑制剂疗效的标志物，这通常是使用免疫组化评估肿瘤组织CD8+T细胞的浸润情况来实现的。而CD28，作为一种共刺激因子信号，也得到了关注。TIL细胞中CD28+的比例越高，通常也预示着治疗得到响应的可能性越大，这也可以通过免疫组化来进行检测。2018年8月一篇Nature的论文中，癌症研究大牛Rosenberg博士发现，在CD8+的TIL中，只有一小部分对肿瘤的抗原敏感，而其它都是吃瓜群众。继续深入地研究发现，CD39的表达差异是区分CD8+TIL是否对肿瘤敏感的关键因子。CD39是一种与慢性免疫细胞刺激有关的分子,通常在多种恶性实体瘤中明显上调。CD8+CD39+的TIL与慢性抗原持续刺激特征符合，表明这类TIL的活性被抑制住了，但是其抗肿瘤能力依然存在，只是需要有外来力量来解除其抗肿瘤能力的抑制，而PD-1/PD-L1抑制剂刚好就可以解除该类抑制。所以CD8+ TIL中CD39+的比例越高，就越可能让PD-1/PD-L1发挥作用。所以CD39+也是一个非常具有潜力的标志物。
DDR通路DNA损伤修复系统主要包括8条通路：baseexcision repair（BER）， check point factors（CPF），Fanconi anemia（FA），homologousrecombination repair（HRR），mismatchrepair（MMR），nucleotide excision repair （NER），non-homologous end-joining（NHEJ）and DNAtranslesion synthesis（TLS）。目前，已有一些研究关注DDR通路基因变异与免疫治疗获益的相关性。例如：MMR基因功能缺陷引起的dMMR（MLH1，MSH2，MSH6，PMS2等）或BER通路的POLE基因突变的患者在免疫治疗中获益更大；具有BRCA2突变的黑色素瘤患者接受免疫治疗预后更好；另有关于尿路上皮癌的研究显示，DDR基因任一突变（该研究中DDR通路包含34基因），患者TMB水平较高且免疫治疗预后更好。NSCLC患者中，携带DNA损伤修复基因有害变异的患者（例如BRCA2， POLE， POLD1， MSH2， RAD51C，PRKDC等），对Nivolumab治疗敏感。doi: 10.1126/science.aaa1348
液体活检生物标志物探索—了解利用ctDNA检测bTMB水平
B-F1RST研究：2018 ESMO大会上发布的重磅研究（B-F1RST），是第一项前瞻性评估bTMB作为Atezolizumab疗效预测标志物的研究。与中期分析结果一致，以既定的bTMB≥16作为cut-off值（临界值），高bTMB组的ORR显著更高、PFS和OS在数值上也观察到更好的趋势。这一结果进一步支持了正在进行的III期研究BFAST以bTMB作为标志物来筛选入组人群。
利用CTC实现PD-L1表达水平的动态监测
近年来，作为液体活检的开路先锋和主要成员，如何检测CTC（循环肿瘤细胞）的分子特征从而反映肿瘤的分子特征，这是大家一直以来关注的问题，也关系到CTC能否在临床上具有越来越大的应用价值。今年3月份发表在Oncoimmunology上的一项研究招募了36名接受PD-1单抗IBI308治疗的晚期消化道肿瘤患者，使用“肿瘤捕手”技术对患者用药前、后分别进行CTC检测，结果发现外周血中有PD-L1高表达CTCs的患者更容易从PD-1药物中获益，而且这类细胞比例越高，响应率越高。研究者表示，PD-L1高表达（PD-L1high）的CTCs的比例可用于预测PD-1单药治疗效果。
外泌体中特定蛋白的检测
外泌体（直径为30-100纳米）和微粒体（直径为100-1000纳米）是由大多数哺乳动物细胞分泌的小泡，并携带因子进行细胞间的通信。肿瘤可释放外泌体和微粒体携带特定蛋白质、mRNA、miRNA和DNA，这些肿瘤分泌囊泡，特别是外泌体，是无创诊断的潜在生物标志物。
使用外泌体作为标记物大有希望克服当前仍然存在于癌症检测的技术挑战，如早期检测的难度，侵入性筛选，低特异性，和假阳性结果。然而，由于这些纳米级别分子成分多样的外泌体与其他细胞外膜泡的分离和成分分析较为繁琐，加之血液中还含有各种各样的细胞存在，因此，基于外泌体的诊断仍然具有很大的挑战。
DNA甲基化
表观遗传学中，CpG（常见甲基化修饰位点）的甲基化是基因表达和组织分化的重要调控方式，癌症发病初期，DNA就可出线甲基化修饰改变，故通过分析甲基化模式，可推断出ctDNA的组织来源，甚至推断出肿瘤类型。Lancet Respir Med发表了一篇新的文章，表示DNA甲基化可能成为PD-1免疫治疗最新预测标志物。该研究通过肿瘤组织DNA的甲基化芯片分析，发现了301个CpG岛的甲基化水平与非小细胞肺癌患者接受PD-1阻断治疗的临床响应显著相关。而基于这301个CpG岛甲基化水平组合而成的EPIMMUNE特征，则是无进展生存率（PFS）和整体生存率（OS）的独立预测指标。
微生物组
有研究小组成员分析了112名接受抗PD-1免疫疗法的患者的口腔与肠道菌群。研究者们发现，PD-1免疫疗法应答者（R）与不应答者（NR）的肠道菌群的多样性和组成具有显著差异。通过病人粪便微生物的分析，R具有明显更高的α多样性和相对丰度的瘤胃球菌科细菌。宏基因组研究揭示了R中肠道细菌的功能与NR差异较大，其体内的合成代谢通路更为丰富，系统免疫力与抗肿瘤免疫力也更强，这些数据对用免疫检查点抑制剂治疗黑素瘤患者具有重要意义。
生物标志物可以协助判断预测治疗有效性。PD-L1与dMMR/MSI-H是目前进入临床实践的免疫治疗生物标志物，新的PD-1/PD-L1抑制剂疗效的预测标记物，如TMB、TILs、POLE等需要更多的临床研究证据支持。另外，液体活检Biomarker的探索也为未来提供了更为广泛的空间。
导 读
1. 可发生于任何免疫检查点抑制剂，但主要见于PD-1/PD-L1抑制剂；PD-1和PD-L1抑制剂在导致HP发生方面无明显差异；
2. 目前HP发生率报道数据不一，初步估计能到10%，但老年患者、头颈部癌伴淋巴结转移的患者发生率增高；
3. 尚未发现HP与肿瘤负荷、肿瘤类型、治疗线数、PD-L1表达水平之间的相关性；
4. 发生HP的患者总体预后查，OS仅仅3-4个月。
超进展（hyperprogression）是相对于“进展”而言，目前尚无标准的定义。综合目前的文献，超进展被定义为肿瘤反常的加速生长，包括：1.在免疫检查点抑制剂治疗后第一次评价时进展，或至治疗失败时间（TTF）﹤2月；2.肿瘤体积增加>50%；3.肿瘤增长速度（TGR）增加>2倍。第一次走入人们的视野，2016年ESMO年会上，Lahmar等在壁报上发表了一篇PD-1/PD-L1抑制剂治疗89例晚期NSCLC患者的单中心回顾性研究，结果显示20例患者在接受治疗后出现进展，其中9例在第一次评价疗效时即发生快速进展，进展速率超过了50%；在这9例患者中，只有1例患者在之后的随访中出现肿瘤回缩，另外8例被作者定义为超进展。但因为这个报道仅仅出现在壁报上，超进展并未引起广泛关注。
超进展引起轰动，2017年初发表在ClinCancer Res上的一篇文章指出，超进展在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者中的发生率约为9%，而在老年患者（>65岁）中则为19%；免疫治疗导致的超进展与肿瘤负荷、肿瘤类型、治疗线数、PD-L1表达水平无相关性，和高龄（>65岁）、差OS相关；主要见于PD-1/PD-L1抑制剂，但PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂在导致超进展发生方面也无明显差异。9%，这已经是个不低的数字了！19%，这已经是一个惊人的数字了！而且，此文报道的患者并不仅限于NSCLC，而是包含20个不同的瘤种。在文中，作者还专门写道：另有18名患者因为在第一次评价疗效之前就出现了明显的临床进展，所以并未纳入统计，因此实际上发生超进展的频率可能远比9%要高。果然，随后的Lancet杂志就发表评述文章，把超进展比作了“可怜的阿喀琉斯”，脚踝又一次被无辜射中了。
同年另一篇报道，认为头颈部鳞癌应用PD-1/PD-L1抑制剂出现超进展的发生率为29%；超进展更常见于在诊断时即有颈部淋巴结转移的患者中；超进展与诊断时的T分期、M分期或肿瘤负荷无关；超进展与差的PFS相关，而与OS无关。
一项多中心队列研究，在2017年ESMO年会上，法国学者Singavi回顾性收集了5个研究中心从2012年11月至2017年3月期间242例接受免疫治疗的晚期NSCLC患者的临床和影像学数据，进而评估超进展的发生率，并指出超进展为患者的预后不良因素，超进展患者的中位OS仅为 3.5个月。
紧随其后，在2017年第18届WCLC上也发表了关于超进展的报道。法国学者Ferrara等对接受晚期NSCLC治疗的患者进行了回顾性分析。研究人员回顾性收集了5年（2012年至2017年）8个不同机构接受过免疫治疗的333例晚期NSCLC患者的数据，中位随访期为12个月；在这些患者中，14％患者发生了超进展，OS仅为3.4个月。
假性进展假性进展（Pseudo-progression）是指治疗初期出现原有病灶增大或出现新病灶，之后出现病灶缩小的现象。这类患者通常体感良好，肿瘤相关症状（乏力和食欲下降等）有改善。假性进展可能是免疫检查点抑制剂激活了免疫细胞，使得免疫细胞大量富集在原发病灶和微小转移灶表面或内部。
这种假性进展与治疗无效肿瘤本身发生进展在影像学上很难区别。一旦出现假性进展，因为和肿瘤复发不易鉴别，会使治疗进程受到很大干扰，如果决策错误，甚至会缩短患者的生存期。对于不同类型的癌症，假性进展发生概率并不同。假性进展在恶性黑色素瘤较为常见，而对于肺癌，发生概率只有1-3%。有些医生的观念是：影像检查改善，免疫治疗有效，继续给药；影像检查有进展，可能是假性进展，还是继续给药。他们可能认为既然患者耐受性良好，有可能获得一年以上的生存收益，为什么不继续治疗，直到出现不容置疑的进展为止？传统化疗方案如果无效，肯定不会继续。这是因为化疗需要患者体质良好，继续无效的治疗方案将导致患者失去下一步治疗的机会。医生和患者往往过于乐观估计假性进展的愿景，然而这只是一廂情愿。推荐进行影像学确认，12周时的评估可能无法确认部分假性进展。部分按照RECIST 1.1标准评估为疾病进展的患者仍有生存获益，综合多标准参考多因素有助于准确评估。据目前研究数据显示在肺癌或其他实体瘤中，假性进展的发生率还是比较低的，未来需要更多的试验数据来评估假性进展，证明假性进展是否可作为临床疗效和增加生存率的替代产物。
“真假”进展区别目前还没有明确的“假性进展”临床评价标准，多数鉴别方法都是基于临床经验的。因此在免疫治疗早期，影像检查出现进展，进行慎重评估非常重要。如果患者在开始免疫治疗的二个月之后出现体重下降，乏力和疼痛加重等症状，影像检查显示进展很可能就是真的进展。由于免疫治疗属于系统性治疗，除个别生理屏障外（血脑屏障、血眼屏障、血睾屏障、血胎屏障），免疫细胞可以巡游全身，因此一般情况下有多个转移灶的“假性进展”通常是同时变化的，例如同时变大。如果出现个别的某个或某几个病灶变化，则应该考虑是真正的病情进展。如果出现除上述生理屏障外的多个病灶同时变化，则考虑是“假性进展”。链接：
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